Butyrat reduziert die zelluläre Magnesiumabsorption unabhängig von der Stoffwechselregulierung in Caco - Guangdong BoldFrontier Technologies Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18551 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Es hat sich gezeigt, dass die Verdauung von Ballaststoffen durch Darmbakterien die intestinale Mineralstoffaufnahme [z. B. Kalzium (Ca2+) und Magnesium (Mg2+)] stimuliert. Obwohl vermutet wird, dass der lokale pH-Wert und die Konzentration kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) die Absorption zweiwertiger Kationen bestimmen, sind die genauen molekularen Mechanismen noch unbekannt. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Auswirkungen von SCFAs auf die Mg2+-Absorption im Darm zu bestimmen. Wir zeigen, dass die Butyratkonzentration im Dickdarm negativ mit den Serum-Mg2+-Spiegeln bei Wildtyp-Mäusen korreliert. Darüber hinaus hemmte Na-Butyrat die Mg2+-Aufnahme in Caco-2-Zellen signifikant, während die Ca2+-Aufnahme unbeeinflusst blieb. Obwohl Na-Butyrat die Gesamt-ATP-Produktionsrate deutlich senkte und zu einer erhöhten Phosphorylierung der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) führte, ging diesen Folgen eine Hemmung der Mg2+-Aufnahme durch Butyrat voraus. Wichtig ist, dass elektrophysiologische Untersuchungen zeigten, dass intrazelluläres Butyrat die Aktivität des heteromeren Mg2+-Kanalkomplexes, des transienten Rezeptorpotentials Melastatin (TRPM), direkt reduzierte6/7. Durch die Blockierung der zellulären Butyrataufnahme wurde dessen hemmende Wirkung auf die Mg2+-Aufnahme verhindert, was zeigt, dass Butyrat intrazellulär wirkt. Unsere Arbeit identifizierte Butyrat als neuartigen Regulator der intestinalen Mg2+-Aufnahme, der unabhängig von der Stoffwechselregulation funktioniert. Dieser Befund unterstreicht zusätzlich die Rolle der mikrobiellen Fermentation bei der Regulierung der Mineralabsorption.

Die Aufnahme von Magnesium (Mg2+) im Darm wird durch verschiedene Aufnahmewege1 erleichtert. Der passive, parazelluläre Transport findet im Dünndarm statt, während der aktive Transport im Dickdarm durch Kanäle der Kationenkanalfamilie des transienten Rezeptorpotentials Melastatin (TRPM), TRPM6 und TRPM7, auf der apikalen Seite2,3 und Cyclin M4 (CNNM4) erleichtert wird. auf der basolateralen Seite der Enterozyten4. Bisher ist wenig über Faktoren bekannt, die die intestinale Mg2+-Absorption regulieren.

Eine orale Mg2+-Supplementierung reicht oft nicht aus, um den Mg2+-Spiegel im Blut bei Krankheiten mit erhöhter Prävalenz von Mg2+-Mangel wie Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM), Bluthochdruck, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und durch Protonenpumpenhemmer (PPI) induzierter Hypomagnesiämie5,6,7 wiederherzustellen. Daher besteht ein dringender Bedarf an alternativen Behandlungsmöglichkeiten, die die Mg2+-Absorption im Darm stimulieren. Die gezielte Nutzung von Ballaststoffen auf die Darmmikrobiota ist eine vielversprechende Strategie, da gezeigt wurde, dass die Fermentation von Ballaststoffen durch Darmbakterien die Mg2+-Absorption im Darm verbessert8,9. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind jedoch noch unbekannt.

Ein möglicher Mechanismus besteht darin, dass kurzkettige Fettsäuren (SCFAs; Acetat, Propionat und Butyrat), die aus der bakteriellen Fermentation komplexer Nahrungskohlenhydrate stammen, an der erhöhten Mg2+-Absorption beteiligt sind10. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass SCFAs als wichtige Signalmoleküle zwischen der Darmmikrobiota und dem Wirt fungieren10,11,12. Tatsächlich stärken SCFAs die Integrität der Schleimhautbarriere, modulieren Immunzellreaktionen und beeinflussen den Cholesterin-, Lipid- und Glukosestoffwechsel in verschiedenen Geweben12. Im Kontext der Darmphysiologie wurde Butyrat am intensivsten auf seine Rolle als primäre Energiequelle für Kolonozyten und seine schützende Wirkung gegen Entzündungen und Darmkrebs untersucht13,14,15.

Präbiotische Ballaststoffe (z. B. Oligofructose, Inulin) erhöhen die Produktion von SCFAs und senken den intraluminalen pH-Wert des Dickdarms. Diese Faktoren erwiesen sich in verschiedenen Versuchsmodellen als vorteilhaft für die Löslichkeit und Absorption von Mg2+8,16,17. Daher wird angenommen, dass die stimulierende Wirkung der Darmmikrobiota auf die Mg2+-Absorption von SCFAs abhängt, entweder durch Ansäuerung des Darmlumens oder durch Beeinflussung aktiver Transportmechanismen. Obwohl diese Konzepte in der aktuellen wissenschaftlichen Literatur weit verbreitet sind, wurden die direkten Auswirkungen von SCFAs auf die intestinale Mg2+-Absorption nie geklärt.

Diese Studie untersuchte die physiologische Rolle von SCFAs bei der Mg2+-Absorption im Darm, indem sie die molekularen Mechanismen aufklärte, durch die SCFAs die Mg2+-Aufnahme in der menschlichen Dickdarmzelllinie Caco-2 modulieren, und indem sie die Mg2+-Spiegel im Serum mit den SCFA-Konzentrationen im Dickdarm bei Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen korrelierte.

Um zu beurteilen, ob aus Mikrobiota stammende SCFAs die Mg2+-Homöostase beeinflussen, wurden Korrelationsanalysen zwischen den SCFAs-Konzentrationen im Dickdarm und den Mg2+-Spiegeln im Serum bei Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen durchgeführt (Abb. 1). Wir haben die relative Konzentration von SCFAs in Dickdarmproben gemessen, die im Rahmen einer früheren Studie18 entnommen wurden. Die lineare Regressionsanalyse zeigte eine signifikante inverse Korrelation der Butyratkonzentrationen im Dickdarm mit den Mg2+-Spiegeln im Serum (P < 0,05, r2 = 0,22) (Abb. 1A). Es wurden keine Korrelationen zwischen den Serum-Mg2+-Spiegeln und den Acetat- oder Propionatkonzentrationen im Dickdarm gefunden (Abb. 1B, C). Es wurden keine Korrelationen zwischen den SCFA-Konzentrationen im Dickdarm und den Ca2+-Spiegeln im Serum gefunden (ergänzende Abbildung S1).

Die Butyratkonzentrationen im Dickdarm korrelieren negativ mit den Serum-Mg2+-Spiegeln bei Mäusen. (A–C) Einfache lineare Regressionsanalysen wurden an den SCFAs-Konzentrationen im Dickdarm durchgeführt, die aus einem zuvor veröffentlichten Datensatz18 erhalten wurden, und an den Mg2+-Spiegeln im Serum von 25 männlichen Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen. Einfache lineare Regressionsanalyse zwischen den Dickdarmkonzentrationen von Butyrat (y = −2,24x + 1,52, r2 = 0,22, P < 0,05) (A), Acetat (y = −0,05x + 1,22, r2 = 0,006) (B), Propionat ( y = 0,15x + 1,15, r2 = 0,003) (C) und Serum-Mg2+-Spiegel. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte dargestellt, wobei die lineare Linie die Beziehung angibt. P < 0,05 gilt als signifikant.

Um den zugrunde liegenden Mechanismus der umgekehrten Korrelation zwischen den Butyratkonzentrationen im Dickdarm und den Mg2+-Spiegeln im Serum zu erklären, untersuchten wir mithilfe des schweren 25-Mg-Isotops, ob Butyrat die Mg2+-Aufnahme in der menschlichen Dickdarmzelllinie Caco-2 beeinflusst. Zellen, die 20 Minuten lang mit 2, 4 oder 8 mmol/L Na-Butyrat inkubiert wurden, hatten im Vergleich zur Kontrolle eine deutlich verringerte 25Mg2+-Aufnahme (100 % vs. 88 % ± 2 vs. 86 % ± 4 vs. 72 % ± 3). , P < 0,05) (Abb. 2A). Bemerkenswert ist, dass auch innerhalb des physiologischen Konzentrationsbereichs (8–40 mmol/l) ein Dosis-Wirkungs-Effekt beobachtet wurde (ergänzende Abbildung S2)15. Eine ähnliche Verringerung der 25Mg2+-Aufnahme wurde in mit Na-Propionat und Na-Acetat inkubierten Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung S2). Weitere Experimente wurden mit der niedrigen physiologischen Konzentration von 8 mmol/L durchgeführt. Die hemmende Wirkung von Na-Butyrat war zeitabhängig, da 8 mmol/L Na-Butyrat zu einer signifikant geringeren 25Mg2+-Aufnahme zwischen 10 und 30 Minuten im Vergleich zu mit der Kontrolle behandelten Zellen führte (P < 0,05) (Abb. 2B). Die 45Ca2+-Aufnahme wurde durch die Na-Butyrat-Behandlung in Caco-2-Zellen nicht gehemmt (ergänzende Abb. S2). Als nächstes wurde Na-Butyrat (0–20 mmol/L) zu einem Magnesiumgrün und MgCl2 enthaltenden Puffer hinzugefügt, um zu testen, ob Na-Butyrat in der Lage wäre, Mg2+ ausreichend zu binden, um die durch die Bindung von Mg2+-Magnesiumgrün vermittelte Fluoreszenz zu verringern. Keine der getesteten Konzentrationen von Na-Butyrat führte zu einer geringeren Fluoreszenzintensität (Abb. 2C). Als Kontrolle für unseren Test reduzierte die Zugabe von 1 mmol/L ATP zum Magnesiumgrün- und MgCl2-haltigen Puffer die Magnesiumgrün-Fluoreszenz um das Zweifache (98 % ± 10 vs. 46 % ± 18, P < 0,05) und 2 mmol/L ATP hob die Fluoreszenz vollständig auf (Abb. 2D). Um festzustellen, ob die Wirkung von Butyrat von intrazellulären Wirkungen abhängt, wurde die Butyrataufnahme über den Monocarboxylattransporter 1 (MCT1) durch den bekannten MCT1-Inhibitor Phloretin19 blockiert. Ähnlich wie bei früheren Experimenten reduzierte eine 20-minütige Inkubation mit 8 mmol/L Na-Butyrat die 25Mg2+-Aufnahme signifikant (100 % vs. 65 % ± 5, P < 0,05) und dieser Effekt wurde durch Zugabe von 1 mmol/L Phloretin (65 %) aufgehoben. ± 5 vs. 101 % ± 10, P < 0,05) (Abb. 2E).

Die Behandlung mit Butyrat führt zu einer verringerten 25Mg2+-Aufnahme in Caco-2-Zellen. (A) 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen nach 20-minütiger Behandlung mit steigenden Konzentrationen von Na-Butyrat (2–8 mmol/L). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). *P < 0,05 gilt als statistisch signifikant im Vergleich zu Kontrollzellen unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett-Korrektur für mehrere Tests. (B) Zeitverlauf der 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen, die 30 Minuten lang mit 8 mmol/L Na-Butyrat (gestrichelte Linie) oder Kontrolle (durchgezogene Linie) behandelt wurden. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). *P < 0,05 wird im Vergleich zu Kontrollzellen zum gleichen Zeitpunkt unter Verwendung des Student-t-Tests als statistisch signifikant angesehen. (C, D) Fluoreszenzintensität von 2 µmol/L Magnesiumgrün in einem 1 mmol/L MgCl2-Puffer mit steigenden Konzentrationen von Na-Butyrat (0–20 mmol/L) (C) und ATP (0–2 mmol/L). ) (D). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 4 (C) und n = 3 (D), jedes Experiment bestand aus Duplikaten). (E) 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen nach 20-minütiger Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat oder 8 mmol/L Na-Butyrat und 1 mmol/L Phloretin. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). *P < 0,05 wird im Vergleich zu Kontrollzellen unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Sidaks Korrektur für mehrere Tests als statistisch signifikant angesehen.

Da Butyrat die primäre Energiequelle für Kolonozyten ist20,21, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Behandlung mit Butyrat zu einer geringeren 25Mg2+-Aufnahme durch Modulation des Zellstoffwechsels führt (Abb. 3). Um dies genauer zu untersuchen, wurden die Auswirkungen der Butyratbehandlung auf die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) und Glykolyse, die beiden wichtigsten Stoffwechselwege, die für die ATP-Produktion verantwortlich sind, mit dem Seahorse Xfe96-Analysegerät untersucht. Die Behandlung von Zellen mit 8 mmol/L Na-Butyrat verringerte die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) (Abb. 3A) und erhöhte die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) (Abb. 3B). Die Quantifizierung der ATP-Produktionsraten zeigte, dass die Butyratbehandlung zu einer deutlich verringerten glykolytischen ATP-Produktion (52,71 ± 2,55 vs. 42,95 ± 2,13 pmol ATP/min/µg Protein, P < 0,05) (Abb. 3C) und einer erhöhten mitochondrialen ATP-Produktion führte ( 23,70 ± 3,35 vs. 29,84 ± 3,17 pmol ATP/min/µg Protein, P < 0,05) (Abb. 3D). Zusammengenommen führte die Butyratbehandlung zu einer deutlich verringerten Gesamt-ATP-Produktion (76,41 ± 2,06 vs. 72,79 ± 2,78 pmol ATP/min/µg Protein, P < 0,05) (Abb. 3E). Im Gegensatz dazu hatte die Behandlung von Zellen mit 8 mmol/l Acetat oder Propionat keinen Einfluss auf die Gesamt-ATP-Produktionsraten, führte jedoch zu einer verringerten glykolytischen und einer erhöhten mitochondrialen ATP-Produktion (ergänzende Abbildung S3).

Die Behandlung mit Butyrat führt zu niedrigeren ATP-Produktionsraten durch Modulation des Zellstoffwechsels. (A, B) Extrazelluläre Ansäuerungsraten (ECAR) (A) und Sauerstoffverbrauchsraten (OCR) (B) von Caco-2-Zellen, die mit Kontrolle (durchgezogene Linie) oder 8 mmol/L Na-Butyrat (gestrichelte Linie) behandelt wurden (zuerst Pfeil), gefolgt von 2 µmol/L Oligomycin (blockiert OXPHOS als Inhibitor der ATP-Synthase; zweiter Pfeil) und einer Mischung aus 0,5 µmol/L Rotenon und Antimycin A (blockiert OXPHOS als Inhibitor des Mitochondrienkomplexes I bzw. III; dritter Pfeil ), gemessen mit dem Seahorse Xfe96-Analysegerät und normalisiert auf Kontrollzellen. Dargestellt sind die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, die Experimente wurden dreifach wiederholt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM mit 12 Wiederholungen pro Bedingung dar. (C–E) Glykolytische (C), mitochondriale (D) und Gesamt-ATP-Produktionsrate (C) der Zellen vor (basal) und nach (induzierter) Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat. Die in (C–E) dargestellten Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar und werden aus einzelnen Spuren von drei unabhängigen Experimenten berechnet, von denen repräsentative Spuren eines Experiments in (A, B) dargestellt sind. *P < 0,05 gilt im Vergleich zur Basalrate unter Verwendung des gepaarten Student-T-Tests als statistisch signifikant.

Um die Butyrat-induzierte Verringerung der gesamten ATP-Spiegel besser zu verstehen, haben wir die Phosphorylierungsgrade der AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) analysiert. AMPK ist der Hauptenergiesensor der Zelle und wird bei niedrigem intrazellulärem ATP22 phosphoryliert. Caco-2-Zellen wurden 5, 10 und 20 Minuten lang mit 8 mmol/L Na-Butyrat, 25 mmol/L Glucose (zur Stimulierung der ATP-Produktion) oder 2 µmol/L Oligomycin (zur Hemmung der ATP-Produktion) behandelt.

Im Vergleich zur Kontrolle führte die Butyrat-Behandlung nach 5 Minuten tendenziell zu einer 1,2-fach höheren AMPK-Phosphorylierung (statistisch nicht signifikant), während die Oligomycin-Behandlung zu einer fast doppelt so hohen AMPK-Phosphorylierung führte (Abb. 4A, D). Die Butyratbehandlung führte jedoch zu einer deutlich höheren AMPK-Phosphorylierung, die nach 10 Minuten fast um das 1,5-Fache (Abb. 4B, E) und nach 20 Minuten um das Zweifache (Abb. 4C, F) betrug. In ähnlicher Weise führte die Behandlung mit Oligomycin zu einer durchweg höheren AMPK-Phosphorylierung nach 10 (Abb. 4B, E) und 20 Minuten (Abb. 4C, F). Umgekehrt führte die Glukosebehandlung, von der bekannt ist, dass sie die ATP-Produktion erhöht, zu einer geringeren AMPK-Phosphorylierung, die erst nach 10 Minuten signifikant war (Abb. 4A–F). Einer der wichtigsten Downstream-Signalwege, die von AMPK reguliert werden, ist der Säugetier-Target-of-Rapamycin-Signalweg (mTOR), an dem S6K als direktes Downstream-Ziel beteiligt ist23. Da aktiviertes AMPK den mTOR-Signalweg hemmt, wurden die Phosphorylierungsniveaus von S6K zu denselben Zeitpunkten untersucht. Nach 5 Minuten wurden keine Auswirkungen der Behandlung mit Butyrat, Glucose oder Oligomycin auf die S6K-Phosphorylierung beobachtet (Abb. 4G, J). Die Butyratbehandlung führte jedoch zu einer deutlich geringeren S6K-Phosphorylierung um das Zweifache nach 10 Minuten (Abb. 4H, K) und um das 2,5-fache nach 20 Minuten (Abb. 4I, L). Zu diesem letzten Zeitpunkt führte die Glukosebehandlung zu einer deutlich höheren S6K-Phosphorylierung um das 1,5-fache (Abb. 4I, L). Alle ursprünglichen Western-Blot-Rohdaten sind in den Zusatzinformationen dargestellt (Ergänzende Abbildungen S4 – S5).

Die Behandlung mit Butyrat beeinflusst die AMPK-Signalübertragung. (A–C) Repräsentative Immunblot-Bilder von pAMPK (62 kDa) und Gesamt-AMPK (62 kDa) von Caco-2-Zelllysaten nach Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat, 25 mmol/L Glucose oder 2 µmol/L Oligomycin für 5 Minuten (A), 10 Minuten (B) und 20 Minuten (C). (D–F) Densitometrieanalyse der pAMPK-Expression, korrigiert um die Gesamt-AMPK-Expressionsniveaus nach 5 Minuten (D), 10 Minuten (E) und 20 Minuten (F) Behandlung mit 8 mmol/l Na-Butyrat, 25 mmol/l Glucose oder 2 µmol/L Oligomycin. (G–I) Repräsentative Immunblot-Bilder von pS6K (70 kDa) und Gesamt-S6K (70 kDa) von Caco-2-Zelllysaten nach Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat, 25 mmol/L Glucose oder 2 µmol/L Oligomycin für 5 Minuten (G), 10 Minuten (H) und 20 Minuten (I). (J–L) Densitometrieanalyse der pS6K-Expression korrigiert um die gesamte S6K-Expression nach 5 Minuten (J), 10 Minuten (K) und 20 Minuten (L) Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat, 25 mmol/L Glucose oder 2 µmol/L Oligomycin. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). *P < 0,05 gilt als statistisch signifikant im Vergleich zu Kontrollzellen unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett-Korrektur für mehrere Tests. Alle ursprünglichen Immunoblots sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S4–S5.

Um zu untersuchen, ob die durch die Butyratbehandlung induzierte Hemmung der Mg2+-Aufnahme von der AMPK-Signalisierung abhängt (Abb. 5), wurden Caco-2-Zellen 5, 10 und 20 Minuten lang mit 8 mmol/L Na-Butyrat und/oder 2 mmol behandelt /L AICAR, eine bekannte AMPK-aktivierende Verbindung24. Wie in früheren Experimenten beobachtet, führte die Butyratbehandlung zu allen Zeitpunkten zu einer deutlich geringeren 25Mg2+-Aufnahme (Abb. 5A–C). Allerdings hatte die AICAR-Behandlung, die zur Aktivierung von AMPK führte, keinen Einfluss auf die 25Mg2+-Aufnahme nach 5 Minuten (Abb. 5A) und führte zu einer höheren 25Mg2+-Aufnahme nach 10 Minuten (Abb. 5B). Dennoch führte die kombinierte Behandlung mit AICAR und Butyrat zu einer deutlich geringeren 25Mg2+-Aufnahme im Vergleich zur Behandlung nur mit AICAR (Abb. 5A–C). Anschließend analysierten wir, ob niedrige intrazelluläre ATP-Spiegel die 25Mg2+-Aufnahme direkt hemmten, indem wir Zellen 5, 10 und 20 Minuten lang mit Oligomycin behandelten. Während eine 5-minütige Behandlung mit Butyrat zu einer deutlich geringeren 25Mg2+-Aufnahme von fast dem 1,5-fachen führte, gab es bei einer 5-minütigen Behandlung mit Oligomycin keine Auswirkungen (Abb. 5D). Nach 10 und 20 Minuten führten die Behandlung mit Butyrat und Oligomycin beide zu einer deutlich geringeren 25Mg2+-Aufnahme (Abb. 5E).

Die Behandlung mit Butyrat verringert die Aufnahme von 25Mg2+ unabhängig von ATP. (A–C) 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen nach Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat und/oder 2 mmol/L AICAR für 5 Minuten (A), 10 Minuten (B) und 20 Minuten (C). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). *P < 0,05 wird im Vergleich zu Kontrollzellen unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Sidaks Korrektur für mehrere Tests als statistisch signifikant angesehen. (D–E) 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen nach Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat oder 2 µmol/L Oligomycin nach 5 Minuten (D). Zeitverlauf der 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen nach Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat oder 2 µmol/L Oligomycin nach 5, 10 und 20 Minuten (E). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). *P < 0,05 wird im Vergleich zu Kontrollzellen zum gleichen Zeitpunkt unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Dunnett-Korrektur für mehrere Tests als statistisch signifikant angesehen.

Anschließend wurden die möglichen direkten Auswirkungen von Butyrat auf die Mg2+-Aufnahme untersucht (Abb. 6). Im letzten Jahrzehnt wurden heteromere TRPM6/7-Kanäle als Hauptregulatoren der Mg2+-Absorption im Dickdarm etabliert2,3. Um zu untersuchen, ob TRPM6/7 an der durch die Butyratbehandlung gehemmten Mg2+-Aufnahme beteiligt ist, wurden Caco-2-Zellen 10 Minuten lang mit 8 mmol/L Na-Butyrat und dem TRPM6/7-Inhibitor NS8593 (30 µmol/L) behandelt3. Wichtig ist, dass die Behandlung von Caco-2-Zellen mit Butyrat und NS8593 zu einer vierfach geringeren 25Mg2+-Aufnahme führte (100 % vs. 24 % ± 2, P < 0,05), ähnlich der Wirkung von NS8593 allein. Dies deutet darauf hin, dass die Butyratbehandlung ihre Wirkung über TRPM6/7 entfaltet (Abb. 6A). Daher haben wir untersucht, ob Butyrat die Aktivität des TRPM6/7-Kanals direkt beeinflussen kann. Transient mit TRPM6/7 transfizierte humane embryonale Nierenzellen (HEK293) wurden einem Ganzzell-Patch-Clamp-Verfahren unter Verwendung von 8 mmol/L Na-Butyrat in der Patch-Pipettenlösung unterzogen. Zellen, die intrazellulärem Na-Butyrat ausgesetzt waren, zeigten im Laufe der Zeit bei + 80 mV und – 80 mV im Vergleich zur Kontrolle deutlich geringere Stromdichten (759 ± 159 vs. 433 ± 53 pA/pF, P < 0,05 und − 45 ± 10 vs. −). 18 ± 4 pA/pF, P < 0,05 bzw.) (Abb. 6B,C). Bemerkenswert ist, dass die Wirkung von intrazellulärem Na-Butyrat insbesondere zu geringeren Stromdichten von TRPM7 führte, da die Stromdichten von TRPM6 nicht beeinflusst wurden (ergänzende Abbildung S6). Alle Originalspuren elektrophysiologischer Aufzeichnungen sind in den Zusatzinformationen dargestellt (Ergänzende Abbildungen S7 – S9).

Intrazelluläres Butyrat führt zu einer geringeren TRPM6/7-Kanalaktivität. (A) 25Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen nach Behandlung mit 8 mmol/L Na-Butyrat und/oder 30 µmol/L NS8593 nach 10 Minuten. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3, jedes Experiment bestand aus Dreifachversuchen). * P < 0,05 wird im Vergleich zu Kontrollzellen unter Verwendung der einfaktoriellen ANOVA mit Sidaks Korrektur für Mehrfachtests als statistisch signifikant angesehen. (B, C) Ganzzellströme, gemessen bei – 80 mV und + 80 mV über die Zeit in TRPM6/7-transfizierten (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP und HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) HEK293-Zellen ohne (Kreise, n = 9). ) oder mit 8 mmol/L Na-Butyrat (Quadrate, n = 11) in der intrazellulären Pipettenlösung (B). Balkendiagramme der aktuellen Amplituden ohne (Kontrolle) oder mit 8 mmol/L Na-Butyrat (Na-Butyrat) in der intrazellulären Pipettenlösung (C). Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM dar. *P < 0,05 gilt im Vergleich zu Kontrollzellen unter Verwendung des Student-t-Tests als statistisch signifikant.

Unsere Studie zeigt, dass Butyrat, eine kurzkettige Fettsäure, die aus der bakteriellen Fermentation gewonnen wird, die TRPM6/7-vermittelte Mg2+-Aufnahme im Darm reduziert, bevor es zu Veränderungen in der Stoffwechselregulation kommt. Diese Schlussfolgerung basiert auf den folgenden Ergebnissen: (i) die Butyratkonzentrationen im Dickdarm korrelieren negativ mit den Serum-Mg2+-Spiegeln bei Wildtyp-Mäusen; (ii) die Butyratbehandlung führt zu einer geringeren 25Mg2+-Aufnahme in der menschlichen Dickdarmzelllinie Caco-2; (iii) die kombinierte Behandlung von Caco-2-Zellen mit Butyrat und Phloretin, einem spezifischen Inhibitor des Butyrattransporters MCT1, verhindert diese geringere 25Mg2+-Aufnahme; (iv) die Behandlung von Caco-2-Zellen mit Butyrat und NS8593, einem TRPM6/7-Blocker, führt zu einer vierfach geringeren 25Mg2+-Aufnahme, ähnlich der Behandlung von Caco-2-Zellen mit NS8593 allein; (v) intrazelluläres Butyrat führt zu einer deutlich geringeren TRPM6/7-Kanalaktivität.

Die Fermentation von Nahrungskohlenhydraten durch die Darmmikrobiota ist mit einer verbesserten Mineralstoffaufnahme verbunden25. Im menschlichen Dickdarm werden Acetat, Propionat und Butyrat in einem Molverhältnis von etwa 60:20:20 mit Konzentrationen zwischen 20 und 140 mmol/l produziert10,26. Acetat und Propionat sind wichtige Modulatoren des Lipid-, Glukose- und Cholesterinstoffwechsels in verschiedenen Geweben, während Butyrat begrenzte systemische Funktionen ausübt, aber ein wichtiger Modulator der Dickdarmhomöostase ist10,15,25. Hier berichten wir, dass nur die Butyratkonzentrationen im Dickdarm, nicht jedoch Acetat und Propionat, mit den Serum-Mg2+-Spiegeln bei Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen korrelierten. Im Dickdarm ist Butyrat die primäre Energiequelle für Enterozyten und wirkt als Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitor15. Diese Funktionen hängen von der Butyratabsorption durch Monocarboxylattransporter (z. B. MCT1)26,27 ab. Wir zeigen nun, dass Butyrat über intrazelluläre Mechanismen zu einer verringerten 25Mg2+-Aufnahme führt, da Phloretin, ein spezifischer Inhibitor des Butyrattransporters MCT1, die hemmende Wirkung von Butyrat auf die 25Mg2+-Aufnahme aufhebt. Insbesondere legen unsere Ergebnisse nahe, dass intrazelluläres Butyrat durch Hemmung der TRPM6/7-Kanäle einen negativen Rückkopplungsmechanismus für die 25Mg2+-Aufnahme initiiert.

Wir haben durch Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente gezeigt, dass intrazelluläres Butyrat im Vergleich zu unbehandelten Zellen zu 1,5-fach niedrigeren TRPM6/7-Strömen führte. Fettsäuren wurden bereits als intrazelluläre Modulatoren der Ionenkanalaktivität beschrieben und können als (Anta-)Agonisten auf TRP-Kanälen (Transient Receptor Potential) wirken28,29,30,31. Es wurde gezeigt, dass mehrfach ungesättigte Fettsäuren, darunter Arachidonsäure, Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure, TRPM8-Ströme in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters hemmen32. Darüber hinaus reduzierten 40 µmol/L Linolsäure (LA) die Ströme sowohl bei negativen als auch bei positiven Membranpotentialen der TRPM8- und TRPV1-Kanäle in Drosophila-S2-Zellen signifikant33. In ähnlicher Weise hemmten 10 µmol/L LA und EPA die durch Capsaicin hervorgerufenen Ströme von TRPV1 in HEK293-Zellen um 82 % bzw. 48 %34. Diese Fettsäuren hemmten kompetitiv die durch Liganden (z. B. Capsaicin) hervorgerufenen TRPV1-Ströme, was auf eine gemeinsame Bindungsstelle schließen lässt34. Obwohl in diesen Studien langkettige Fettsäuren untersucht wurden, deuten unsere Daten auf einen ähnlichen Mechanismus für SCFA-Butyrat hin.

Im Allgemeinen werden zwei Mechanismen in Betracht gezogen, um die Wirkung von Butyrat auf die TRPM6/7-Aktivität zu erklären: Die SCFA kann direkt an den Kanal binden oder die Lipiddoppelschicht beeinflussen28,35. Butyrat fungiert als Ligand für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) wie GPR43 (FFAR2) auf Darmepithelzellen10,13. Die Aktivierung von GPR43 durch Butyrat stimuliert die Aktivität der Phospholipase C (PLC), die wiederum Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in Diacylglycerin (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) umwandelt36. Da die TRPM7-Aktivität durch die Hydrolyse von PIP237,38,39 negativ reguliert wird, könnte die Hypothese aufgestellt werden, dass Butyrat die TRPM7-Aktivität indirekt durch die Hydrolyse von PIP2 über die Aktivierung von GPR43 an der Zelloberflächenmembran hemmt. Dieser Mechanismus ist jedoch unwahrscheinlich, da die hemmende Wirkung von Butyrat auf den TRPM6/7-Kanal spezifisch für die intrazelluläre Butyratanwendung war. Die negative Regulierung der TRPM6/7-Aktivität durch Butyrat könnte durch direkte Interaktion mit dem Kanal oder durch indirekte Regulierung über inhibitorische Wege wie den PKC/RACk1-Weg40 verursacht werden. Daher sind Strukturstudien erforderlich, um festzustellen, ob es innerhalb der TRPM6/7-Kanäle Interaktionsstellen für Butyrat gibt.

Obwohl wir zeigen, dass eine durch Butyrat vermittelte verringerte Mg2+-Aufnahme den Auswirkungen der Butyrat-Behandlung auf die Stoffwechselregulation vorausgeht, können wir nicht ausschließen, dass verringerte ATP-Spiegel zur langfristigen hemmenden Wirkung der Butyrat-Behandlung auf die 25Mg2+-Aufnahme beitragen. Obwohl die Butyrat-abhängige Hemmung der 25Mg2+-Aufnahme den Auswirkungen der Butyrat-Behandlung auf die ATP-Produktion vorausging, führte die Blockierung der ATP-Produktion durch Oligomycin-Behandlung auch zu einer signifikant geringeren 25Mg2+-Aufnahme nach 10 und 20 Minuten. Zu diesen Zeitpunkten führten sowohl die Butyrat- als auch die Oligomycin-Behandlung zu einer deutlich höheren Phosphorylierung von AMPK, was einen intrazellulären Zustand mit niedrigem ATP bestätigte. Diese Hemmung ähnelt der, die bei AMPK-aktivierenden Arzneimitteln wie Metformin41 beobachtet wird. Eine 24-stündige Vorinkubation mit Metformin oder AICAR reduzierte die 25Mg2+-Aufnahme in Caco-2-Zellen und in der Nierenzelllinie mDCT1541 signifikant. Unsere Ergebnisse zeigen, dass niedrige intrazelluläre ATP-Spiegel mit einer verringerten Mg2+-Aufnahme einhergehen. Somit könnte Butyrat eine doppelte Rolle bei der verringerten Mg2+-Aufnahme spielen, indem es die TRPM6/7-Aktivität akut beeinflusst und die intrazellulären ATP-Spiegel in einer verzögerten Reaktion senkt.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Butyrat einen negativen Rückkopplungsmechanismus für die Mg2+-Absorption im Dickdarm bei der Aufnahme von Ballaststoffen darstellt. Es ist bekannt, dass Ballaststoffe das Darmlumen ansäuern und dadurch die Löslichkeit von Mg2+ im Dickdarm erhöhen8,9,16,17,42. Wenn die luminale Konzentration an ionisiertem Mg2+ höher ist, sollte die Permeabilität für Mg2+ im Dickdarm verringert werden, um die Mg2+-Absorption stabil zu halten. Da Ballaststoffe auch die mikrobielle Diversität und damit die Produktion von Butyrat erhöhen43,44, stellt Butyrat ein hervorragendes Signalmolekül zur Reduzierung der Mg2+-Kanalaktivität dar. Da es bei der Fermentation von Ballaststoffen zu Schwankungen der Butyratkonzentrationen kommt45,46, werden die TRPM6/7-Kanäle nicht ständig gehemmt. In Anbetracht der Tatsache, dass die Mg2+-Absorption über TRPM6/7-Kanäle im proximalen Dickdarm hoch ist und dieser Darmabschnitt von Butyrat-produzierenden Bakterien dominiert wird10,47,48, könnte Butyrat als negativer Regulator der Mg2+-Absorption in diesem Abschnitt wirken. Obwohl die Butyrat-Supplementierung in einer früheren Studie nicht zu Unterschieden in der Serum-Mg2+-Konzentration oder der fäkalen Mg2+-Extrusion zwischen Butyrat- und Kontrollmäusen nach 1 und 14 Tagen Behandlung in einer früheren Studie führte49, zeigten unsere Korrelationsanalysen, dass der Butyratgehalt im Dickdarm umgekehrt mit dem Serum zusammenhängt Mg2+-Spiegel in einem physiologisch relevanten Umfeld.

Unsere Studie ist die erste, die molekulare Erkenntnisse darüber liefert, wie SCFAs die intestinale Mg2+-Aufnahme beeinflussen. Wir zeigen, dass die Behandlung mit Butyrat zu einer verringerten 25Mg2+-Aufnahme durch schnelle Hemmung der TRPM6/7-Kanäle führt, was metabolischen Konsequenzen vorausgeht. Insbesondere Patienten mit Mg2+-Mangel können von einem niedrigen Molverhältnis von Butyrat profitieren, um die Mg2+-Absorption optimal zu verbessern.

Serumelektrolytkonzentrationen und organische Säurekonzentrationen aus dem Dickdarminhalt (Fermentationsbrühe) wurden in männlichen Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen bestimmt, die ausführlich von Gommers et al.18 beschrieben wurden. Diese Studie wurde von der Tierethikkommission der Radboud-Universität Nijmegen (RU DEC 2015-0112) und von der niederländischen Zentralkommission für Tierversuche (CCD, AVD103002016382) genehmigt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Die Konzentrationen organischer Säuren wurden im Dickdarminhalt (Fermentationsbrühe) von Mäusen bestimmt. Kurz gesagt, der Dickdarminhalt wurde viermal mit 1 mol/L Perchlorsäure (HClO4, Sigma-Aldrich, USA) verdünnt, um die organischen Säuren freizusetzen. Proteine und Fett in der Fermentationsbrühe wurden durch Ultraschall ausgefällt und durch 10-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g entfernt. Organische Säuren, einschließlich der SCFAs, wurden durch Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie (HPAEC) mit UV- und Brechungsindex-(RI)-Detektion bestimmt. 25 µL des Überstands wurden auf eine Vorsäule in Reihe mit zwei analytischen Rezex ROA Organic Acids H+-Säulen (Phenomenex, USA) injiziert. Die organischen Säuren wurden isokratisch mit 5 mmol/L Schwefelsäure (H2SO4) mit einer Flussrate von 0,60 ml/min eluiert. Der Säulenofen wurde auf einer Temperatur von 60 °C gehalten. Die Datenanalyse wurde mit der Chromeleon-Software Version 7.2 (Thermo Scientific) durchgeführt. Quantitative Analysen wurden unter Verwendung von Standards der organischen Säuren (Sigma-Aldrich, USA) durchgeführt.

Die Serum-Mg2+-Konzentrationen wurden mit einem kolometrischen Xylidyl-IL-Blau-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Roche/Hitachi, Tokio, Japan) bestimmt und bei 600 nm auf einem Bio-Rad Benchmark Plus Mikroplatten-Spektrophotometer (BioRad, Hercules, Kalifornien, USA) gemessen. USA). Die Serum-Ca2+-Spiegel wurden mit der o-Kresolphthalein-Komplexon-Methode50 gemessen. Kurz gesagt, o-Kresolphthalein-Farbreagenz (Sigma, Zwijndrecht, Niederlande) wurde mit den Proben und Standards inkubiert und die Absorption wurde sofort bei 570 nm gemessen. Sowohl Mg2+- als auch Ca2+-Messungen wurden unter Verwendung von Precinorm U (Roche, Basel, Schweiz) als Kontrolle durchgeführt.

Die menschliche Karzinomzelllinie Caco-2 (ATCC® HTB-37™, Passage Nr. 4–21) wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium mit 25 mmol/L HEPES und 4,5 g/L Glucose (DMEM, Lonza, Belgien) gehalten und ergänzt mit 4 mmol/L l-Glutamin (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA), 5 % (v/v) fötales Rinderserum (FBS, HyClone, GE Healthcare Life Sciences, Illinois, USA), 1 % (v/v). ) nicht-essentielle Aminosäuren (Biowest, MO, USA) und 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin (Gibco, New York, USA). Die Zellen wurden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % (v/v) CO2 gehalten und 21 Tage lang oder anders angegeben kultiviert. Das Kulturmedium wurde jeden zweiten Tag gewechselt und die Zellen wurden einmal pro Woche passiert, wenn eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht war. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 0,5 × 105 Zellen pro cm2 ausgesät. Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293; ATCC®-1573™, Passage Nr. 11–18) wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % (v/v) FBS, 10 µL/ml nicht-essentieller Aminosäuren und 2 mmol/L l, gezüchtet -Glutamin.

Die Wirkung von Na-Butyrat auf die Mg2+-Bindung wurde mit dem zellimpermeanten Magnesiumgrün-Pentakaliumsalz (Life Technologies, Oregon, USA) untersucht. 100 µmol/L Stammlösungen von Magnesiumgrün wurden in MQ hergestellt. Der Arbeitspuffer enthielt 2 µmol/L grünen Magnesiumfarbstoff, 115 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 0,1 mmol/L EGTA und 10 mmol/L Tris-HCL, pH 7,2. Die Farbstoffaffinitäten für Mg2+ wurden zunächst in Abwesenheit von Na-Butyrat im Konzentrationsbereich von 0–10 mmol/L MgCl2 getestet, was einen Kd ~ 1,0 mmol/L ergab (Standardkurve, Daten nicht gezeigt). Anschließend wurde dem Arbeitspuffer Na-Butyrat im Bereich von 0–20 mmol/L zugesetzt (angepasste Osmolarität mit NaCl). Die Fluoreszenz wurde auf einem Tecan I-control Infinite200 pro (Thermo Fisher Scientific) bei einer Absorption von 500 nm und einer Emission von 535 nm gemessen.

Die Mg2+-Aufnahme durch Caco-2-Zellen wurde unter Verwendung des stabilen 25-Mg-Isotops (Cortecnet, Voisins Le Brettoneux, Frankreich) bestimmt. Wir haben das nicht radioaktive stabile Isotop 25 Mg (natürliche Häufigkeit 10 %) verwendet, das von 24 Mg (natürliche Häufigkeit 80 %) und 26 Mg (natürliche Häufigkeit 10 %) unterschieden werden kann. Zu diesem Zweck wurden die Zellen über Nacht von Mg2+ und Serum befreit. Zu Beginn des Experiments wurden die Zellen einmal mit einem vorgewärmten basischen Aufnahmepuffer (in mmol/L) gewaschen: 125 NaCl, 5,0 KCl, 0,5 CaCl2, 0,5 Na2HPO4, 0,5 Na2SO4, 15 HEPES, pH 7,5 eingestellt mit NaOH. Anschließend wurden den Zellen 500 µL basischer Aufnahmepuffer mit 1,0 mmol/L 25MgO zugesetzt. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Zellen dreimal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in HNO3 (≥ 65 %; Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) bei 65 °C für 15 Minuten lysiert. Die 25Mg2+-Aufnahme durch die Zellen wurde durch induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS)-Analyse (Naturwissenschaftliche Fakultät, Radboud-Universität, Nijmegen) bestimmt. Die Berechnungen wurden auf der Grundlage des normalisierten Verhältnisses zwischen 25 mg und Gesamt-Mg (24 mg + 25 mg + 26 mg) durchgeführt (ein Anstieg der intrazellulären 25 mg verändert das Isotopenverhältnis im Vergleich zu seiner normalen Häufigkeit).

Caco-2-Zellen wurden mit 25 µmol/l BAPTA-AM (1,2-Bis(o-aminophenoxy)ethan-N,N,Nʹ,Nʹ-tetraessigsäureacetoxymethylester) (Invitrogen, Eugene, USA) vorbehandelt 30 Min. bei 37 °C. Anschließend wurden die Zellen einmal mit warmem Krebs-Henseleit-Bicarbonatpuffer (KHB) (in mmol/l) gewaschen: 110 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 Na-Acetat, 2 NaHPO4 und 20 HEPES, pH 7,4 ( NaOH), gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation mit KHB-Puffer, ergänzt mit Inhibitoren spannungsgesteuerter Calciumkanäle, 10 μmol/L Felodipin und 10 μmol/L Verapamil sowie 1 μCi/ml 45Ca (Charge: 17M431A, Perkin Elmer, MA, USA). ) bei 37 °C. Anschließend wurde der Assay durch dreimaliges Waschen der Zellen mit eiskaltem KHB-Puffer, ergänzt mit 0,5 mmol/L CaCl2 und 1,5 mmol/L LaCl3, gestoppt. Die Zellen wurden in 0,05 % (v/v) SDS-Lösung geerntet, gemischt mit Opti-Flour O (Perkin Elmer, MA, USA). Die 45Ca-Aufnahme wurde dann mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Hidex SL 600, Hidex) quantifiziert.

Die extrazellulären Versauerungsraten (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wurden mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XFe96 (Agilent Technologies, Texas, USA) gemessen. Seahorse V3-Kulturplatten wurden mit 50 µg/ml Fibronektin beschichtet. Anschließend wurden Caco-2-Zellen mit einer Dichte von 0,5 × 105 Zellen pro cm2 ausgesät und zwei Tage lang kultiviert. Vor der Messung wurde den Zellen über Nacht Serum entzogen. Eine Stunde vor dem Lauf wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit Agilent Seahorse XF DMEM Medium pH 7,4 (103575-100; mit 5 mmol/L HEPES, ohne Phenolrot und Natriumpyruvat, Agilent Technologies, Texas, USA) ergänzt inkubiert mit 10 mmol/L Glucose bei 37 °C, ohne CO2. Nach den Basalmessungen erhielten die Zellen eine akute Injektion von 8 mmol/l Na-Butyrat, Na-Acetat oder Na-Propionat, gefolgt von 2 μmol/l Oligomycin A und einer Mischung aus 0,5 μmol/l Rotenon und 0,5 μmol/l Antimycin A. Ein Messzyklus bestand aus 3 Minuten Inkubationszeit und 3 Minuten Messzeit. OCR- und ECAR-Werte wurden auf den Gesamtproteingehalt normalisiert. Die ATP-Produktionsraten wurden wie von White et al.51 beschrieben berechnet.

Die Zellen wurden in eiskaltem Lysepuffer lysiert, der (in mmol/l) enthielt: 50 Tris-HCl, 1 EGTA, 1 EDTA, 10 Natriumglycerophosphat, 1 Natriumorthovanadat, 10 Natriumfluorid, 10 Natriumpyrophosphat, 270 Saccharose und 150 NaCl mit 1 % (v/v) Triton ml). Die Proteinkonzentrationen wurden mit Bradford gemäß dem Protokoll des Herstellers (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) bestimmt. Die Proben wurden in Laemmli-Puffer mit 100 mmol/L Dithiothreitol (DTT) 30 Minuten lang bei 37 °C denaturiert, einer SDS-PAGE (20 µg) unterzogen und auf Polyvinyliden (PVDF)-Membranen übertragen. Die Membranen wurden in 5 % (w/v) fettfreier Trockenmilch (NFDM), gelöst in 1 × Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS)-T (TBS mit 0,1 % (v/v) Tween-20), für 45–60 blockiert min bei Zimmertemperatur. Anschließend wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primärem Antikörper (Kaninchen-pAMPKα (Thr172) (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, USA, #2535), Kaninchen-AMPKα (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, USA) immungeblottet , #5831), Kaninchen pS6K(Thr389) (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, USA, #2708), Kaninchen S6K (1:1000, Cell Signaling Technologies, Danvers, USA, #9234). Denn diese Antikörper haben Nachdem die Membranen umfassend charakterisiert wurden und zu den am weitesten verbreiteten auf diesem Gebiet gehören, wurden sie vor der Hybridisierung mit Antikörpern geschnitten, um Material zu sparen. Dies wurde so durchgeführt, dass die Kanten etwa 20 kDa von der erwarteten Größe des interessierenden Proteins entfernt waren Am nächsten Tag wurden die Blots dreimal in TBS-T gewaschen, um ungebundene Primärantikörper zu entfernen, und mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertem Sekundärantikörper (PO α-Kaninchen 1:10.000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) inkubiert ) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen mit TBS-T wurden die Proteine mit Chemilumineszenzreagenz (SuperSignal West Femto/Pico, Thermo Scientific, Waltham, USA) sichtbar gemacht und mit Bio-Rad Chemidoc XRS verarbeitet. Die optimale Belichtungszeit wurde ermittelt und speziell auf jeden Blot angewendet, um eine Unter- oder Überbelichtung zu verhindern. Die Bandendichten wurden durch densitometrische Analyse mit der Image J-Software (Version 2.0) quantifiziert.

HEK293-Zellen wurden mit 0,5 μg Maus-TRPM7-Plasmid (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP) und 0,5 μg menschlichem TRPM6-Plasmid (HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) bei einem DNA:Lipofectamin-Verhältnis von 1:2 für 36 transfiziert –48 Std. Für Einzeltransfektionen wurden HEK293-Zellen mit 1 μg menschlichem TRPM6 (HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) oder 1 μg Maus-TRPM7 (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen) bei einem DNA:Lipofectamin-Verhältnis von 1:2 transfiziert 36–48 Std. Vor Beginn der Experimente wurden Zellen auf Glasdeckgläsern ausgesät, die mit 50 μg/ml Fibronektin (Roche, Mannheim, Deutschland) beschichtet waren. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur in die Aufzeichnungskammer gegeben und anhand der Intensität des Fluoreszenzreporters (GFP) ausgewählt. Alle Experimente wurden mit einem EPC-10-Verstärker und der Patchmaster-Software (HEKA ElectroniK GmbH, Lambrecht, Deutschland) durchgeführt und analysiert. Das Abtastintervall wurde auf 200 ms eingestellt und die Daten wurden bei 2,9 kHz tiefpassgefiltert. Patch-Clamp-Pipetten wurden aus dünnwandigem Borosilikatglas (Harvard Apparatus, March-Hugstetten, Deutschland) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen 1 und 3 MΩ, wenn sie mit der Pipettenlösung gefüllt waren, die 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Na2EDTA und 10 enthielt mmol/L HEPES, pH 7,3 eingestellt mit NaOH. Die extrazelluläre Lösung enthielt 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L HEPES und 1 mmol/L CaCl2, pH 7,4 eingestellt mit NaOH. 400 mmol/L Stammlösungen von Na-Butyrat wurden in MilliQ (MQ) hergestellt, mit einer Endkonzentration von 8 mmol/L Na-Butyrat in der Pipettenlösung. Die Serienwiderstandskompensation wurde in allen Experimenten auf 75–95 % eingestellt. Ab einem Haltepotential von 0 mV wurde alle 2 s eine lineare 500 ms lange Spannungsrampe von – 100 auf + 100 mV angelegt. Die Stromdichten wurden durch Normalisierung der Stromamplitude auf die Zellkapazität mithilfe der Igor Pro-Software (Wavemetrics, Oregon, USA) ermittelt. Balkendiagramme zeigen die Stromdichten bei + 80 und − 80 mV 200 s nach dem Einbruch in die Zelle.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Sofern nicht anders angegeben, wurden Vergleiche zwischen zwei Gruppen mit dem ungepaarten Student-t-Test analysiert, nachdem die Normalverteilung mit dem Shapiro-Wilk-Test getestet wurde. Aufgrund der wiederholten Messcharakteristik des Seahorse-Analysators wurden diese speziell mit einem gepaarten Student-T-Test getestet. Vergleiche von mehr als zwei Gruppen wurden mittels einer einfaktoriellen ANOVA analysiert, gefolgt von einem Post-hoc-Test nach Dunnett oder Sidak, um Mehrfachvergleiche zu korrigieren. Korrelationsanalysen wurden mithilfe einer einfachen linearen Regression durchgeführt. Zur Durchführung der statistischen Analysen wurde GraphPad Prism (Version 8) verwendet.

Die Rohdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir danken Desirée Bos von der Abteilung für Radiologie und Nuklearmedizin des Universitätsklinikums Radboud, Nijmegen, Niederlande, und Daan Panneman von der Abteilung Translational Metabolic Laboratory des Universitätsklinikums Radboud, Nijmegen, Niederlande, für ihre technische Unterstützung beim Magnesiumgrün Experimente und Seepferdchenmessungen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (J. Hoenderop, NWO VICI 016.130.668 und J. de Baaij, NWO VENI 016.186.012) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jeroen HF de Baaij und Joost GJ Hoenderop.

Abteilung für Physiologie, Radboud Institute for Molecular Life Sciences (RIMLS), Radboud University Medical Center (Radboudumc), Postfach 9101, 6500 HB, Nijmegen, Niederlande

Lisanne MM Gommers, Pieter A. Leermakers, Jenny van der Wijst, Sara R. Roig, Anastasia Adella, Melissa AE van de Wal, René JM Bindels, Jeroen HF de Baaij und Joost GJ Hoenderop

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LMMG, JvdW, JHFdB und JGJH konzipierten Forschung; LMMG, JvdW, SRR, PAL, RJMB, JHFdB und JGJH analysierten und interpretierten Daten; LMMG, JvdW, SRR, MvdW und AA führten Untersuchungen durch; LMMG, JvdW, PAL, JHFdB und JGJH haben den Artikel geschrieben; Alle Autoren hatten Zugriff auf die Studiendaten und überprüften und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Joost GJ Hoenderop.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gommers, LMM, Leermakers, PA, van der Wijst, J. et al. Butyrat reduziert die zelluläre Magnesiumabsorption unabhängig von der Stoffwechselregulation in menschlichen Caco-2-Kolonzellen. Sci Rep 12, 18551 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21683-6

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Eingegangen: 01. März 2022

Angenommen: 30. September 2022

Veröffentlicht: 03. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21683-6

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